Cancer Cell：T 细胞和 B 细胞给肿瘤编织了「天罗地网」！

免疫系统可以在前期抑制肿瘤的发生，但是随着肿瘤的发展，肿瘤细胞可以通过多种机制抑制免疫系统，实现「免疫逃逸」。

(资料图)

想要清楚肿瘤免疫和免疫逃逸的发生过程，就需要明确肿瘤组织中免疫细胞的功能状态及其相对于肿瘤细胞的组织结构。

来自哈佛大学的 Sandro Santagata 团队尝试使用「空间定量分析」，即使用高度精确的空间剖面搭配一套分析和计算方法，以期确定以下几点：

（1）免疫细胞、肿瘤细胞和基质细胞的特性和分子特征；

（2）影响这些细胞类型和空间组织的物理、化学因素；

（3）生成肿瘤对治疗反应随时间和空间的动态变化。

研究者以 Kras/Trp53 突变 (KP) 的基因工程小鼠模型（GEMM）为原型，通过气管内给与编码 Cre 重组酶的慢病毒来刺激肿瘤的发生，并将该模型命名为 KP-Cre。该模型会在每个二维肺横截面产生 10-15 个肿瘤结节，并在 1-5 个月内完成从增生到腺癌的过程。

首先，研究者使用多模式数据集成对小鼠模型的肿瘤微环境进行初步分析

研究者在给 KP GEMM 小鼠气管内递送肿瘤起始慢病毒之后对小鼠进行免疫治疗。肿瘤生成 6-9 周后，分别使用 H&E 染色、mRNA 原位杂交（ISH）和 24 倍循环免疫荧光（CyCIF）对肿瘤的甲醛固定石蜡包埋（FFPE）组织连续切进行分析。

在 CyCIF 分析中，研究者将识别出肿瘤组织中的单个细胞，并对单个细胞的染色强度进行量化，利用单个细胞相对于肿瘤结节、边缘和血管的距离，构建出「细胞网络图形」（图 1）。

图 1：小鼠肿瘤组织内部 H&E、mRNA 和 CyCIF 分析的图像结果

接着，研究者使用特定抗原刺激肿瘤的免疫系统

由于 KP-Cre 小鼠肿瘤体细胞突变负荷较低，新生抗原较少，肿瘤免疫未能高效激活。为了激活肿瘤免疫，研究者在肿瘤细胞中引入了两种 CD8+T 淋巴细胞抗原：鸡卵清蛋白 SIINFEKL（SIIN) 和合成肽 SIYRYYGL（SIY）。引入抗原后的模型被命名为 KP-LucOS。

相比较 KP-Cre 小鼠模型，KP-LucOS 小鼠模型的肿瘤生长得到了明显抑制。

对肿瘤微环境的分析发现，虽然两种小鼠模型的肿瘤组织中浸润免疫细胞并没有显著差异，但是非肿瘤组织中浸润的免疫细胞有很大不同。

相比 KP-Cre 小鼠模型，KP-LucOS 模型的非肿瘤组织中浸润的自然杀伤细胞（NK）、辅助 T 淋巴细胞（Th）和细胞毒 T 淋巴细胞（Tc）以及 CD103+树突状细胞（DC）增加了 3.3-8 倍，这可能是肿瘤抑制的原因之一（图 2）。

图 2：KP-Cre 和 KP-LucOS 模型肿瘤免疫微环境的不同

然后，研究者在肿瘤组织中鉴定出淋巴细胞网

通过对每个样本单独进行 Delaunay 三角测量，研究者绘制出了细胞之间的位置关系图谱，进而在肿瘤组织中确认出一个个淋巴细胞网（Lymphonet），既有由不到 10 个淋巴细胞小簇组成的，也有由多余 100 个直接接触的淋巴细胞组成的。

淋巴细胞网的大小和其细胞成分之间存在一定关系，越大的淋巴细胞网会有越多的 B 淋巴细胞。而且，小于 16 个细胞的淋巴细胞网基本不存在 B 淋巴细胞。这个提示，淋巴细胞网起初由 T 淋巴细胞组成核心，随后通过募集 B 淋巴细胞生长（图 3）。

图 3：肿瘤组织中的淋巴细胞网及其构成细胞特点

随后，研究者发现 CXCR3 配体参与调节淋巴细胞网的形成

已知 CXCL9 和 CXCL10 趋化因子（以及人类的 CXCL11）与 CXCR3 受体的结合可以介导 T 淋巴细胞在肿瘤微环境中的募集，而淋巴细胞网主要由 T 淋巴细胞组成，因此研究者推测 CXCR3 启动了淋巴细胞网的形成。

研究者使用 CRISPR 激活法在 KP-Cre 小鼠肿瘤中异位表达 CXCL10，成功使 CXCL10 在 mRNA 水平增加了 38 倍。

而在高表达 CXCL10 之后，淋巴细胞网的数量和大小显著增加，并促进了 B 淋巴细胞和所有 T 淋巴细胞亚群的募集。这说明，CXCL10 在肿瘤微环境中的表达可以促进淋巴细胞网的形成和生长（图 4）。

图 4：肿瘤微环境中的 CXCL10 的转录可以促进淋巴细胞网的形成

之后，研究者确认了淋巴细胞网在肿瘤免疫中的角色

研究者分别使用两种免疫治疗方法治疗 LucOS 小鼠：

（1）接种针对 SIIN 和 SIY 抗原的治疗性疫苗（Vax）；

（2）注射靶向 PD-1/CTLA-4 的免疫检查点抑制剂（ICB）。

Palantir（一种使用多维表达数据沿着分化轨迹排列单细胞的算法）分析所得数据可以对细胞类型和状态进行划分，将 T 淋巴细胞状态分为：S1 未成熟状态；S2A 增殖性/细胞毒性状态；S2B 细胞毒性/早期衰竭状态；S3 衰竭/功能障碍状态以及三种过度状态（T1-3）。据此可以检测两种免疫治疗对诱导 Tc 状态的影响。

分析发现，在未经治疗的 LucOS 小鼠中，大多数 Tc 细胞是未成熟（幼稚）状态（S1）。但 Vax 和 ICB 治疗可以将淋巴细胞转化为肿瘤免疫作用更强的细胞毒性（S2）和耗竭（S3）状态。

通过组织定位分析发现，代表增殖/细胞毒性的 S2A 状态往往在距离肿瘤较远的位置募集，而代表细胞毒性/耗竭的 S2B 状态在肿瘤内部更多。这提示，S2A 状态的淋巴细胞在肿瘤远端形成后迁移到肿瘤内部，参与了肿瘤免疫的过程，最终转化为 S2B 状态。

通过流式细胞术对两种免疫治疗后 SIIN 和 SIY 特异性的 Tc 细胞进行分析，结果发现 Vax 可以更好的促进 SIIN 和 SIY 特异性 T 淋巴细胞的激活，而 ICB 会额外作用于其它 Tc 群体。这些额外激活的 Tc 细胞可能对肿瘤相关抗原有反应，也可能是对非肿瘤相关抗原产生反应。

进一步分析发现，具有细胞毒性潜力的细胞与淋巴细胞网中的 TCF1+PD-1+祖细胞存在共定位。而已知 TCF1+PD-1+祖细胞会在在肿瘤组织中转化为 Tc 细胞，这表明祖细胞可以在淋巴细胞网中分化成熟为 Tc 细胞以响应免疫治疗（图 5）。

图 5：淋巴细胞网在肿瘤免疫中的作用

最后，作者在人类肺腺癌组织中进行了验证

人体组织的分析结果发现，在 KP-GEMM 模型中鉴定出的淋巴细胞网在人类肺腺癌组织中也大量存在，并且特征和动物模型相似。这提示淋巴细胞网在人体肿瘤组织中支持祖细胞 CD8+T 淋巴细胞成熟方面具有类似的功能（图 6）。

图 6：人肺腺癌组织中的淋巴细胞网

本文的结果发现，免疫细胞在对肿瘤抗原发生反应时，其空间排列会发生显著变化。T 淋巴和 B 淋巴细胞在「淋巴细胞网」 中被募集，其中包含祖 T 淋巴细胞。在免疫治疗后，祖细胞可能会在「淋巴细胞网」 独特的免疫环境中分化和激活，进而产生细胞毒性 T 淋巴细胞，最终参与肿瘤的免疫过程。

点评专家

点评内容

在肿瘤免疫微环境中，免疫细胞和肿瘤细胞如何相互作用一直是肿瘤免疫研究的热点。但作为抗肿瘤免疫应答主力军的 T 细胞和 B 细胞，如何在空间结构上相互协作发挥抗肿瘤的作用，我们亦所知甚少。

日前，来自哈佛大学的研究小组在 Cancer Cell 上发表文章，报道了主要由 T、B 细胞形成的「淋巴细胞网」结构（Lymphonet），在 PD-1 单抗或肿瘤疫苗刺激下，可作为「士兵培训基地」大量产生细胞毒性 T 细胞，介导免疫监视。这一研究发现并命名了一个新的免疫系统结构 ——「Lymphonet」，揭示了 Lymphonet 在抗肿瘤免疫应答中的功能及形成的分子机制，为免疫治疗提供了新的 biomarker 及潜在的治疗靶点。

值得注意的是，Lymphonet 与既往发现的免疫检查点抑制剂疗效正相关的三级淋巴样结构（TLS），存在较多相似性，但 TLS 发育的成熟程度及在不同类型的肿瘤中均存在较大异质性，研究者通过动态观察也有同样疑问：「Lymphonet」是否可能为 TLS 的前体，这将为 TLS 研究开启新的方向。

另外，研究发现肿瘤疫苗可同时活化两种类型的 T 细胞：S2A 型以及 S2B  型，而 PD-1 单抗仅活化 S2B  型，同时空间共定位发现 S2B 型细胞更多聚集于 Lymphonet。这进一步证实 PD-1 单抗可能是通过活化耗竭前体 T 细胞（TCF-1+PD-1+T 细胞，也聚集于 Lymphonet）发挥抗肿瘤免疫应答的机制。有意思的是肿瘤疫苗不仅活化了 S2B T 细胞，还可活化具有杀伤和增殖功能的 S2A 型细胞，而该细胞聚集于肿瘤远处，猜想可能来自外周循环。因此，该研究也为肿瘤疫苗与免疫检查点抑制剂的联合治疗提供了新的思路。

参考文献：

Gaglia G, Burger ML, et al. Lymphocyte networks are dynamic cellular communities in the immunoregulatory landscape of lung adenocarcinoma. Cancer Cell. 2023 Apr 8:S1535-6108(23)00088-0.